На 1 л среды добавляли 10 мл раствора микроэлементов минеральной основы а и б, которые отдельно стерилизуют, смешивают, к смеси добавляют глюкозу —2,0 г/л (стерильная), NaHCO2 — 0,1 г/л (стерильный).
Все растворы готовятся на дистиллированной воде.
Морская вода иногда заменяется минеральной основой среды Вишняк. Способ приготовления смеси гидролизата желатины и витамина В указан Вишняк и Уотсоном.
Для подавления роста морской бактериальной флоры в описанные среды добавляли антибиотики (пенициллин и стрептомицин). Последние разводили прямо во флаконах (стандартная упаковка антибиотиков для инъекций) стерильной морской водой и стерильно переносили в колбы с охлажденной средой непосредственно перед разливом ее в чашки Петри. Растворы антибиотиков готовили из расчета 100 000 ед. на 100 мл среды.
Грунт набирали пипетками на 10 мл с отбитыми носиками. После внесения проб в чашки туда же наливали по 15 мл охлажденной агаризиванной среды с антибиотиками и тщательно перемешивали ее с пробой Талломы.
Водоросли раскладывали стерильно прокаленным пинцетом кусочками, примерно в 1 см длиной на пластинку застывшей агаризованной среды. Чашки инкубировали при температуре 18—22°. Выросшие колонии грибов учитывали, но выделяли в чистую культуру одну колонию из нескольких одинаковых. Рост бактерий отсутствовал. Культуры грибов выделяли в пробирки на скошенное агаризованное сусло (без антибиотиков).
Просмотр чашек с пробами и «приманкой» под бинокулярной лупой и под микроскопом мы начинали на следующие сутки и вели ежедневно
До сих пор речь шла о выделении низших грибов из проб воды и грунта.
Вишняк описала результаты использования кусочков водорослей на предложенной ею агаризованной среде в чашках для выделения низших грибов. Кусочки или пряди водорослей примерно в 1 см длиной отрезали от собранного растения, осторожно протягивали под краем чашки Петри для удаления лишней влаги и помещали на поверхность агаризованной среды с антибиотиком для выделения грибов. На чашках наряду с низшими грибами довольно часто вырастали колонии плесеней и дрожжей.
Некоторую модификацию описанного метода предлагают Фуллер. Фиулес и Мак Лофлин. Они несколько изменили состав среды, рекомендованный Вишняк Агар — 1.2%, Экстракт печени — 0,01%, дрожжевой экстракт (вместо витамина В1) — 0,01%.
Антибиотики (те же) вносили по 0,5 г в 1 л еще незастывшей среды. Выделенные ими филаментозные низшие грибы авторы несколько раз пересевали на среду с антибиотиками для окончательной очистки от бактерий и только после этого помещали на ту же среду без антибиотика. Наряду с нитчатыми низшими грибами этот метод позволял выделять одноклеточные формы из Thraustochytriaceae.
Агаризованные питательные среды при работе с грибами-паразитами беспозвоночных применяли Вишняк и Джонсон.
Надо отметить, что питательные среды при работе с зоопаразитами, если они способны на них расти, используются главным образом для очистки от бактерий, протозоа и последующего изучения физиологических свойств гриба-паразита. Наблюдение цикла развития ведется обычно путем прямого микроскопирования гриба в теле животного-хозяина.
Другая очень большая группа грибов, выделенная из морских областей обитания, представлена сумчатыми и несовершенными грибами, которые существенно отличаются от низших грибов морфологией, физиологией (пищевыми потребностями) и образом жизни. В подавляющем большинстве апротрофами.
Указанные отличия и определяют несколько иной подход к выделению в чистую культуру этих грибов. Прежде всего, они не требуют органического азота и способны усваивать более трудно доступный углерод, например, путем разложения различных целлюлозосодержащих субстратов. Гифомицеты выделяют обычно чашечным методом с твердой питательной среды, приготовленной на морской воде.
Спарроу, изучая грибное население ила Вудс-Холлского залива, использовал декстрозопептонный агар на морской воде (декстрозы 10 г/л, пептона 2 г/л). Стержни ила были разделены на кусочки величиной с горошину, суспендированы в 1 мл стерильной воды н высеяны на чашки со средой. Все наружные слои стержня перед посевом были удалены прокаленным шпателем. Чашечный метод позволил выделить целый ряд грибов, относящихся к Fungi imperfecti и обычно обильно представленных в почве.
Сипманн выделял высшие мицелиальные грибы из грунтов эстуария, р. Везер — на среде агаризованное сусло с добавлением красителей (бенгальский розовый) и на каррагеновом агаре (Carragenagar). Из грунта готовили суспензию в стерильной морской воде с места отбора, и I мл суспензии вносили в чашку Петри с остывшей питательной средой.
Стил изучал микофлору воды и песка на островах и атоллах Тихого океана. Для выделения дрожжей и мицелиальных форм грибов он применял метод фильтрования через мембранные фильтры (0,45 мк диаметр пор) воды с последующим раскладыванием фильтров на питательные среды и метод разведения песка 1 : 10 до 1 : 100 000. Суспензию песка вносили в незастывшую среду. Были использованы казеиновый агар, агар для выделения дрожжей. В среды добавляли 0,05% хлорамфеникола для подавления бактериального роста.
Грибы из классов Fungi imperfecti и Ascomycetes на водорослях и высших растениях можно обнаружить путем прямого мнкроскопирования талломов и срезов через толстые части типа рецептакул аскофиллума и путем раскладывания маленьких кусочков водорослей или высших растений на поверхность застывших питательных сред.
При выделении грибов из эстуарных осадков Борут и Джонсон применяли следующие среды: агар Чапека, картофельно-декстрозный агар и агар Сабуро на водопроводной воде (2 г глюкозы, 1 г пептона. 20 г агара на 1 л). Последняя среда оказалась наиболее перспективной.
Резюмируя вышеизложенное, можно сказать, что подавляющее большинство методов являются заимствованными из смежных дисциплин, довольно громоздки и ограничивают возможности исследователя, вынуждая его работать или вблизи лабораторий, или на больших судах с хорошо оснащенной лабораторией. Кроме того, существующие методы дают лишь отдельные сведения о тех формах, которые удается получить в культуре.
Пока еще остаются совершенно недоступными сведения о развитии грибной популяции в естественных условиях, о смене видов, участвующих на разных этапах разложения органического вещества моря, н о взаимоотношениях между грибами и другими членами морских биоценозов. Все это говорит о том, что методическая часть морской микологии очень несовершенна и требует дальнейшей модернизации.
